1. 江南大学食品学院, 江苏无锡214036 ; 2. 无锡杰西医药科技有限公司, 江苏无锡214036 ;3. 中山大学药学院, 广东广州510089)
摘 要: 为筛选大叶紫薇叶中具有降血糖活性的成分,采用3 T32L1 细胞葡萄糖消耗模型作为检测手段,对大叶紫薇叶提取物采用HP220 树脂吸附、溶剂萃取、制备薄层分离和制备高效液相分离,导向筛选具有降血糖作用的各分离组分。结果发现,大叶紫薇叶中corosolic acid、熊果酸和总三萜具有降血糖活性。
关键词: 大叶紫薇; 3 T32L1 细胞; 降血糖; 结构
大叶紫薇( L agerst roemi a s pecious L . ) 为千屈菜科的落木乔木,主要生长于澳洲和亚洲,在我国广东、广西、福建等地也有种植,在菲律宾和亚洲其他国家,大叶紫薇被称为banaba ,大叶紫薇的叶、花、果和茎传统上被用来制作保健饮料,具有降血糖、抗氧化和减脂等功能[1 - 5 ] 。近年来,大叶紫薇对糖尿病的治疗作用日益引起人们的重视,日本、美国、菲律宾等许多国家对其降糖和治疗糖尿病的功效成分和药理作用进行了广泛研究[6 - 9 ] 。明确大叶紫薇中的降血糖活性成分,对开发大叶紫薇产品具有重要的意义。
3 T32L1 细胞是一种成纤维细胞,在胰岛素、地塞米松、32甲基212异丁基等作用下,具有转变为脂肪细胞的能力,近年来,被广泛应用于有关糖尿病的研究中[10 - 11 ] ,作者采用3 T32L1 前脂肪细胞葡萄糖消耗实验模型作为降血糖有效成分的筛选模型,对大叶紫薇中的降血糖活性成分进行筛选。
1 材料与方法
1. 1 试剂与仪器
大叶紫薇叶( L agerst roemi a s pecious L . ) , 产于广西和广东。corosolic acid :纯度≥95 % ,Chro2madex 公司产品;硅胶G:青岛海洋化工厂产品。正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、冰醋酸、香草醛、高氯酸等均为分析纯;葡萄糖氧化酶试剂盒、葡萄糖、L2谷氨酰胺:上海华美生物公司产品;胰岛素、12甲基232异丁基黄嘌呤、地塞米松:美国Sigma 公司产品;3 T32L1 细胞,美国A TCC 提供。
CO2 培养箱、超净工作台酶标仪、显微镜、旋转真空浓缩器、冷冻干燥机、Water s600HPLC、Pyris21型差示扫描量热仪( DSC ) 、R200D 型电子微量天平、UV —754 紫外可见分光光度计、Water s Plat2form ZMD 4000 液相色谱仪、岛津IR2440 红外光谱仪、恒温水浴锅、电热烘箱、超声发生器等。
1.2 实验方法
1.2.1 3 T32L1 细胞的培养及诱导分化 将3 T32L1 细胞接种于培养瓶中,用含质量分数10 %小牛血清的高糖DMEM 培养液培养,待细胞铺满瓶璧后,换用诱导分化培养液培养48 h ,然后换以含1μg/ mL 的胰岛素培养液再培养48 h ,再换用含质量分数10 %小牛血清的高糖DMEM 培养液培养继续培养,每48 h 换培养液一次,待90 %以上的3 T32L1细胞呈现脂肪细胞表型时, 再用于葡萄糖消耗实验。
1.2.2 葡萄糖消耗能力的测定 将诱导分化成熟的3 T32L1 细胞换上含质量分数012 %BSA 的含药培养液,在24 孔培养板中温育48 h ,然后检测培养液中的葡萄糖残量,计算含药培养的葡萄糖消耗值,同时测定空白对照组的葡萄糖消耗值,按下式计算样品的葡萄糖消耗值能力。
式中: E 为三萜化合物对3 T32L1 细胞葡萄糖消耗提高率%; C0 为培养前孔中葡萄糖浓度(mmol/ L) ;C1 为加三萜化合物组培养后孔中葡萄糖浓度(mmol/ L) ; C2 为对照组培养后孔中葡萄糖浓度(mmol/ L) 。
1.2.3 提取分离步骤 大叶紫薇叶先经热水和乙醇分别提取, 得热水提取物(WE) 和乙醇提取物(AE) ,热水提取物经过浓缩后上HP220 大孔树脂柱分别以水和乙醇进行洗脱,得水提取物水洗部分(WEW) 和醇洗部分(WEA ) ; 乙醇提取物浓缩,真空干燥后后分别以石油醚、乙酸乙脂和正丁醇萃取各3 次,分别得石油醚萃取物、乙酸乙脂萃取物和正丁醇萃取萃取物,其中乙酸乙脂萃取物经过制备薄层分离后得8 条条带, 分别为PTLC1 、PTLC2 ??PTLC8 ,其中PTLC6 经过制备高效液相进一步分离为PHPLC1 和PHPLC2 。对其中的强活性单体化合物进行结构分析。
1.2.4 制备薄层分离 将萃取物在经活化(105 ℃,30 min) 的1 mm 厚的质量分数015 %羧甲基纤维素钠2硅胶G 薄板上条状点样,同时在点样部分旁点上相同的溶液作为对照样,在层析缸中展开,展开后取出,挥干溶剂,在对照样的部分喷质量分数为10 %的硫酸乙醇溶液,105 ℃烘箱中10 min显色,然后刮取于红紫色部分相对应的样品部分的条带,用甲醇为溶剂,经200 W 超声提取、洗脱3次,每次10 min ,洗脱液合并后真空浓缩, 加少量水冻结,冷冻干燥。
1.2.5 制备高效液相分离 采用Water s600 溶剂泵系统, Water s600 控制单元和Water s2487 双波长检测器; 色谱柱:μBondparkTM C18 10 μm , 718mm ×250 mm ;流量:3 mL/ min ;检测波长:206 nm进样量:100μL ;流动相:V (体积分数60 %乙腈) ∶V (体积分数012 %甲酸) = 60 ∶40 。
1.2.6 高活性组分定性反应 对高活性组分分别进行醋酐2浓硫酸反应(Liebermann2Burchard 反应,LB 反应) ,五氯化锑反应( Kahlenberg 反应) ,三氯醋酸反应( Rosen2Heimer 反应) ,氯仿2浓硫酸反应(Salkowski 反应) 和冰醋酸2乙酰氯反应( Tschu2gacff 反应) 。
1.2.7 熔点测定 准确称量1～2 mg 样品平铺于铝制坩埚内,使之与低面紧密接触,仪器先用铟和锌准确较正后,对样品进行差示扫描量热(DSC) 测定,扫描速率4 ℃/ min ,用冰浴作为降温介质,氮气为清扫气体。
1.2.8 红外光谱测定 采用岛津IR2440 红外光谱仪器,溴化钾压片,扫描波长400～4 000 cm21 。
1.2.9 紫外光谱测定 将样品溶于乙醇溶液中,在190 - 300 nm 的波长范围内,每隔一定的波长测定溶液的吸光度值,绘制溶液的吸光度曲线。
1.2.10 质谱测定 质谱条件:离子方式: EIS( m/ z200～1500) ; 毛细管电压: 3188 kV ,锥孔电压: 38V ;离子源温度:120 ℃;脱溶剂气温度:250 ℃;光电倍增器电压:650 V ;分析器真空度:216～510 mPa ;体积流量:412 L/ h 。
1.2.11 核磁共振测定 核磁共振仪上测定氢谱(1 H2NMR) ,全去偶碳谱(13 C2NMR) ,以四甲基硅烷( TMS) 为内标物。
2 结果和讨论
2.1 各组分的活性
将大叶紫薇叶的水提取物、醇提取物和醇提取物各萃取组分进行葡萄糖消耗实验,结果见表1 。
从表1 中可见,011 g/ L 、110 g/ L 和1010 g/ L的水提取物和011 g/ L 乙醇提取物P > 0105 ,与空白相比不显著,而1010 g/ L 乙醇提取物P < 0105 ,与空白相比显著;110 g/ L 乙醇提取物P < 01001 与空白相比非常显著,表明促进葡萄糖消耗能力的活性成分可能存在于乙醇提取物中。乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物中,石油醚和乙酸乙酯萃取物活
性都非常显著( P < 01001) 。采用1 mm 厚的硅胶G 薄板,对乙醇提取物的石油醚和乙酸乙酯萃取物进行分离,发现石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物三萜类组分基本相同,由于石油醚萃取物呈油状,分离困难,因此,采用乙酸乙酯萃取物进行分离,得8 个组分PTLC12PTLC8 ,对各
组分进行葡萄糖消耗实验,结果见表2 。
从表2 可见,组分PTLC3和PTLC6 具有明显的促进葡萄糖消耗能力, 经过HPLC 分析, 组分PTLC3 为单一组分, 而PTLC6 为单二个组分,PTLC6 经过制备液相分离, 得PHPLC1 和PHPLC2 ,对这二组分进行活性测定,结果见表3 。
从表3 可见,组分PHPLC1 具有明显的促进葡萄糖消耗率的作用。
2.2 活性组分结构分析
2.2.1 PTLC3 和PHPLC1 的定性反应 活性分析表明,PTLC3 和PHPLC1 具有较强的活性,因此,对PTLC3 和PHPLC1 进行定性反应,结果如表4 。
三萜类化合物在无水情况下,与强酸(硫酸、磷酸、高氯酸等) 作用,会出现呈色反应或呈荧光,主要是以上试剂使羟基脱水、增加双键结构,再经双键移位,双分子缩合等反应生成共轭双烯系统,又在酸作用下形成阳碳离子盐而呈色,所以产生一系列呈色反应。分离的各组分各种颜色反应均呈阳性,表明各分离组分可能含有三萜类化合物,但由于三萜类组分所发生的一些呈色反应,甾体化合物也有类似反应,所以,所分离的化合物是否为三萜化合物还需要进一步进行红外、核磁等结构分析。
2.2.2 PTLC3 结构分析 结构分析结果如下:
以上数据与文献报道的熊果酸相同[12 ] ,鉴定为熊果酸。
2.2.3 PHPLC1 结构分析 对斑点PHPLC1 进行质谱分析,其相对分子质量为472 ,与文献报道的corosolic acid 的相对分子质量相同,表明其可能为corosolic acid。对其与corosolic acid 对照品进行ESI - 和ESI + 的谱图比较,结果见图1 ,发现它们基本相同。进一步进行薄层对照,结果见图2 ,两者的Rf 相同,进一步证明PHPLC1 化合物为corosolic acid。
3 结 论
1) 大叶紫薇叶中三萜化合物corosolic acid 对促进3 T32L1 细胞葡萄糖消耗影响显著,具有降血糖的功能。
2) 首次发现大叶紫薇叶中存在熊果酸,与总三萜化合物都具有显著促进3 T32L1 细胞葡萄糖消耗的能力,也具有降血糖的功能作用。
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